Jumat, 19 April 2013

Materi Kuliah Mikrobiologi BAB 3

Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
1
III. METODE DAN PRINSIP LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
Prosedur dan peralatan tertentu digunakan untuk memperlajari mikroorganisme,
misalnya : memelihara, memisahkan (mengisolasi) dalam biakan murni, mengamati
karakter dan mengidentifikasi. Telah diketahui bahwa mikroorganisme berada dimanamana
dalam jumlah yang sangat banyak dan beranggotakan banyak spesies. Atas dasar
bahwa jumlah dan jenis mikroorganisme yang sangat banyak serta ukurannya yang
sangat kecil maka metode dan prosedur laboratorisnya sangat khusus. Oleh karena itu
untuk mempelajari spesies atau jenis mikroorganisme tertentu maka langkah pertama
adalah memisahkan mikroorganisme yang bersangkutan dari jenis mikroorganisme yang
lain. Disampinng itu, karena ukuran mikroorganisme sangat kecil maka tidak terlihat
jelas oleh mata, sehingga untuk mengamatinya diperlukan alat pembesar, berupa
mikroskop. Prosedur laboratoris harus dikembangkan atau diarahkan supaya mampu
memisahkan setiap mikroorganisme untuk dikulturkan (ditumbuhkan) secara terpisah.
Kumpulan atau massa mikroorganisme dari spesies sama yang dikulturkan secara
terpisah dan bebas dari mikroorganisme lain disebut sebagai biakan murni. Massa
mikroorganisme dari satu spesies yang sama disebut koloni. Oleh karena itu biakan murni
idealnya hanya mengandung satu koloni saja.
Biakan murni yang pertama, diperoleh J. Listar (1879) menggunakan metode seri
pengenceran dalam medium cair, namun demikian biakan murni dalam medium cair sulit
membentuk koloni yang terpisah sehingga akhirnya dikembangkan medium padat. Oleh
karena itu, biakan murni harus dikembangkan dalam mikrobiologi karena sangat
bermanfaat di segala bidang kegiatan mikrobiologi, baik untuk pengamatan karakter,
penelitian sampai pemanfaatan keunggulannya atau mikrobiologi terapan.
A. MIKROSKOP DAN MIKROSKOPI
Mikrobiologi dapat dianggap dimulai sejak manusia dapat membuat alat pembesar
yang cukup mampu melihat benda yang sangat kecil. Meskipun barangkali Antony
van Leeuwen Hoek (1632-1723) bukan orang pertama yang melihat bakteri dan
protozoa, tetapi dialah yang melaporkan pertama kali melihatnya, kemudian
menggambar dan mendiskripsikan mikroorganisme. Alat pembesar yang digunakan
Leeuwenhoek merupakan mikroskop pertama dengan menggunakan lensa tunggal.
Mikroskop sekarang merupakan mikroskop menggunakan lensa majemuk. Mikroskop
merupakan salah satu alat yang erat sekali hubungannya dengan mikrobiologi,
khususnya untuk melihat bayangan mikroorganisme dan bagian-bagiannya yang
ukurannya sangat kecil.
Tubuh mikroskop pada dasarnya terdiri dari bagian mekanik, bagian optik dan
beberapa jenis dilengkapi bagian elektrik, fotografi dan scanning. Bagian mekanik
dan bagian optik selalu ada pada setiap jenis mikroskop, meskipun tidak semua subBambang
Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
2
bagian ada. Bagian mekanik meliputi : statif, tubus, revolver, meja benda, pengatur
tubus, pengatur kondensor, pengatur meja benda dan pengatur preparat. Bagian
optiknya meliputi : lensa okuler, lensa obyektif, lensa kondensor, lensa filter dan
sumber cahaya.
Bayangan benda (obyek) yang kita lihat dibentuk dan diperbesar oleh lensa
obyektif, di dalam tubus mikroskop membentuk bayangan nyata terbalik dari obyek.
Bayangan nyata tersebut selanjutnya dibalik dan diperbesar lagi oleh lensa okuler.
Lensa okuler merupakan lensa yang berfungsi untuk membuat bayangan terakhir,
sehingga bayangan tersebut dapat dilihat langsung oleh mata pengamat.
Lensa yang baik diperoleh dengan memperhatikan pembesaran dan daya pisahnya.
Semakin pendek jarak titik api lensa akan semakin kuat pembesarannya, sehingga
semakin besar kemampuan suatu lensa akan semakin kecil jarak dua titik api yang
berdekatan yang dapat dilihat secara terpisah menggunakan mikroskop.
Beberapa lensa obyektif biasanya dipasang pada roda berputar yang disebut
revolver. Setiap lensa obyektif dapat diputar ke tempat yang sesuai dengan
pembesaran yang diinginkan. Lensa obyektif dibuat dalam beberapa pembesaran yang
berbeda, yakni : 4x, 10x, 40x, dan 100x, demikian juga lensa okuler tersedia beberapa
pembesaran, yakni : 4x, 10x, 16x, dan 20x. Lensa okuler dipasang paada ujung dalam
tubus dan biasanya yang dipasang adalah yang pembesaaran 10x. Dengan demikian
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
3
jika kita mengamati obyek menggunakan lensa okuler pembesaran 10x dan lensa
obyektif 40x, maka pembesaran obyek yang kita lihat menjadi 400x dibanding
besarnya obyek yang sebenarnya.
Pembesaran total merupakan pembesaran obyektif kali pembesaran okuler. Pada
lensa obyektif biasanya tertera ukuran pembesarannya, aparatur numerik, panjang
tubus lensa, dan tebal gelas penutup yang diperlukan.
Contoh tulisan peneraan lensa obyektif di bawah ini, yang
maksudnya:
1. Pembesaran lensa obyektif = 100 x
2. Aparatur numerik (AN) = 1,25
3. Panjang tubus = 160 mm
(diukur dari lensa obyektif ke lensa okuler)
4. Tebal gela penutup preparat = 0,17 mm
5. Tulisan “Plan” menunjukan permukaannya datar, “POL”
untuk mikroskop polarisasi, “Ph” untuk fase kontras
Kondensor berfungsi sebagai pengatur intensitas caahaya yang masuk ke dalam
mikroskop. Kondensor mempunyai dua bagian penting, yaitu :
1. Susunan lensa untuk mengumpulkan sinar sebelum masuk ke dalam obyek
dan lensa obyektif.
2. Diafragma berfungsi untuk mengatur sinar tepi yang masuk ke dalam lensa
obyektif dan okuler.
Hukum fisika menyatakan bahwa bagian terkecil yang dapat kita lihat disebut
daya pisah, yaitu : kemampuan lensa untuk menghasilkan bayangan terpisah dari dua
titik yang berdekatan. Daya pisah dibatasi oleh panjang gelombang ( ) cahaya yang
digunakan untuk menerangi preparat dan aparatur numerik (AN) lensa-lensa dalam
mikroskop.
ℎ    
=

ℎ    
! + _$
%
Untuk memperjelas hukum fisika tersebut, misalnya di dalam pengamatan
menggunakan panjang gelombang cahaya 0,5 μm, NA lensa obyektif 1,20 dan lensa
kondensor 0,8, maka daya pisah mikroskop tersebut :
ℎ    
=
&,( )*
+,,(-&,.
= 0,23 2 maksudnya bahwa jika ada dua titik yang
jaraknya 0,23 μm atau kurang, dan diamati menggunakan mikroskop tersebut akan
tampak hanya satu titik, sedangkan titik atau benda yang tampak terpisah jaraknya
harus lebih dari 0,23 μm. Oleh karena itu, menurut rumus diatas, untuk meningkatkan
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
4
kemampuan mikroskop dilakukan dengan cara menurunkan daya pisah (d). Nilai daya
pisah akan turun jika panjang gelombang cahaya dikecilkan atau dengan cara
memperbesar aparatur numerik.
Batas daya pisah pada cahaya biasa yang dapat dilihat mata ± 0,2 μm, sehingga
dua benda yang jaraknya kurang dari 0,2 μm akan terlihat sebagai satu benda, begitu
juga benda yang ukurannya kurang dari 0,2 μm tidak akan terlihat jika menggunakan
sumber cahaya biasa. Oleh karena itu untuk melihat benda yang ukurannya kurang
dari 0, 2 μm atau melihat dua benda yang jaraknya kurang dari 0, 2 μm diperlukan
sumber cahaya lain yang mempunyai panjang gelombang lebih pendek. Panjang
gelombang cahaya yang digunakan dalam mikroskop cahaya terbatas pada gelombang
cahaya kasat mata yang berkisar dari 0,4 μm sampai 0,7 μm dan angka singkapan
0,85 pada medium udara dan 1,2 sampai 1,4 pada medium celup cair.
Untuk menggambarkan daya pisah, misalnya panjang gelombang cahaya biasa
yang digunakan untuk mengamati preparat kering maka daya pisahnya = 700 nm / 0,85 =
824 nm (= 0,824 μm) sedangkan jika kita menggunakan filter lensa hijau panjang
gelombang turun menjadi 550 nm, maka daya pisahnya menjadi = 550 nm / 0,85 = 467
nm (0,467 μm). Jika menggunakan preparat celup minyak NA lensa menjadi sebesar
1,25 dan NA kondensor sebesar 0,9, sehingga daya pisahnya menjadi 550 nm/(1,25+0,9) =
225 nm (0,225 μm). Dengan demikian benda-benda dalam preparat kering yang
diamati menggunakan mikroskop cahaya akan terlihat jika ukurannya lebih dari 0,824
μm dan terlihat terpisah jika jaraknya lebih dari 0,824 μm, sedangkan dengan
memilih cahaya hijau ukuran benda yang terlihat dan jarak yang terpisah menjadi
0,467 μm dan jika menggunakan preparat celup minyak daya pisahnya menjadi lebih
besar lagi atau ukuran benda yang terlihat dan jarak yang terpisah menjadi lebih kecil,
yaitu 0,225 μm.
Ada beberapa macam mikroskop cahaya, misalnya : mikroskop pantul cermin,
mikroskop lampu listrik, mikroskop medan gelap, mikroskop fase kontras.
Disamping mikroskop cahaya biasa, ada pula mikroskop sinar yang tak terlihat mata
dan mempunyai daya pisah yang sangat tinggi, yaitu : mikroskop ultraviolet,
mikroskop elektron transmisi, dan mikroskop elektron pemayaran (scanning,
terfokus)
Mikroskop biasa atau mikroskop medan terang yakni mikroskop yang sistem
pencahayaannya menggunakan teknik medan terang. Mikroskop medan terang ada
dua tipe, yaitu mikroskop pantul cermin dan mikroskop lampu listrik yang pada
dasarnya keduanya mempunyai kemampuan yang sama, yaitu cahaya pantulan dari
cermin dan cahaya langsung dari lampu listrik, yang mempunyai panjang gelombang
antara 400 nm sampai 700 nm. Pada mikroskop ini, obyek disinari oleh cahaya dari
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
5
kondensor yang kemudian cahaya ditangkap oleh lensa obyektif. Bagian obyek atau
preparat yang transparan atau medannya akan kelihatan lebih terang, sedangkan
bagian yang berwarna atau tebal akan menyerap cahaya, sehingga lebih gelap. Oleh
karena itu, mikroskop yang menggunakan sistem ini disebut mikroskop medan terang.
Mikroskop medan gelap (Dark-field microscope) pada prinsipnya sama dengan
mikroskop biasa, tetapi menggunakan kondensor khusus dan lensa obyektif yang nilai
NA-nya rendah. Kondensor yang digunakan akan mengarahkan berkas cahaya ke
dalam medan preparat pada sudut yang sedemikian hingga hanyalah berkas-berkas
cahaya yang mengenai obyek pada medan preparat dibiaskan dan memasuki lensa
obyektif atau kondensor yang mampu membentuk kerucut hampa cahaya. Berkas
cahaya dari kerucut hampa dipantulkan dengan sudut yang sangat kecil dari bagian
permukaan gelas benda dan setiap berkas cahaya yang sampai ke preparat akan
dipantulkan langsung ke dalam lensa obyektif, sehingga obyek menjadi terang dengan
latar yang gelap. Mikroskop medan gelap digunakan untuk mengamati
mikroorganisme yang masih hidup, khususnya yang selnya sangat tipis atau yang
hampir mendekati batas daya pisah mikroskop. Mikroskop jenis ini akan mempunyai
medan gelap total jika pada meja benda tidak terdapat preparat atau spesimen.
Mikroskop fase kontras merupakan suatu tipe mikroskop cahaya yang
memungkinkan terjadi kontras yang cukup besar antara obyek pada berbagai
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
6
ketebalan atau berbagai indeks bias. Terjadinya kontras tersebut disebabkan karena
pada mikroskop ini menggunakan kondensor dan lensa obyektif yang khusus dapat
mengendalikan iluminasi obyeknya pada perbedaan ketebalan dan indeks bias yang
sangat kecil yang diwujudkan dalam tingkatan terang-gelapnya cahaya, sehingga
bayangan obyek menjadi kontras lebih nyata.
Mikroskop fluoresensi digunakan untuk memeriksa preparat yang telah diwarnai
menggunakan pewarna fluorokrom. Zat pewarna ini menyerap cahaya gelombang
pendek dan memancarkan cahaya gelombang panjang yang lebih banyak. Zat yang
demikian disebut flouresen dan fenomenanya disebut flouresensi.
Mikroskop elektron merupakan mikroskop yang menggunakan pencahayaan
gelombang elektron. Mikroskop elektron memiliki kemampuan daya pisah yang besar
karena sinar elektron mempunyai panjang gelombang yang sangat pendek
dibandingkan dengan cahaya biasa. Panjang gelombang sinar elektron yang
digunakan berkisar antara 0,005 μm (5 nm) sampai 0,0003 μm (0,3 nm), sedangkan
mikroskop cahaya biasa menggunakan panjang gelombang 0,4-0,7 μm (400-700 nm).
Pembesaran akhir pada mikroskop elektron dapat mencapai 1.000.000 kali.
B. MEDIUM TUMBUH
Untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme diperlukan
substrat yang disebut medium kultur atau medium biakan. Medium kultur ini
mengandung ramuan zat hara (nutrien) tertentu. Zat-zat hara digunakan oleh
mikroorganisme untuk pertumbuhan, sintesis protein, kebutuhan energi untuk
kehidupannya. Biasanya medium kultur mengandung air, sumber energi, zat hara
(nutrien) untuk sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen, hidrogen, dan unsurunsur
mikro. Di dalam bahan dasar medium kultur dapat juga ditambahkan faktorfaktor
pertumbuhan yang berupa asam amino, vitamin, hormon, maupun nukleotida.
Supaya mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang dengan baik, medium kultur
memerlukan persyaratan tertentu, yaitu:
1. Medium kultur harus mengandung semua unsur hara yang diperlukan untuk
pertumbuhan dan reproduksi
2. Medium kultur harus mempunyai tekanan osmose, tegangan permukaan, dan
keasaman dalam (pH) yang sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme.
3. Medium kultur harus dalam keadaan steril. (Sebelum ditanami medium
kultur harus bebas dari mikroorganisme)
Berdasarkan kepada persyaratan ketersediaan di atas, maka medium kultur dapat
berupa medium alami dan medium buatan.
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
7
1. Medium alami merupakan medium kultur yang disusun dari bahan-bahan alami
tanpa ditambah bahan atau senyawa lain. Contoh: kentang, tepung jagung, daging,
telur, ikan, umbi-umbian dan lain-lain.
2. Medium buatan merupakan medium kultur yang dibuat dari susunan berbagai
senyawa kimia. Contoh:
1. Potato Dextrose Agar untuk kultivasi jamur secara umum komposisi per liter:
Agar ..................................................................25.0g
Glucose .............................................................20.0g
Pancreatic digest of casein..................................2.5g
Yeast extract........................................................0.5g
MgSO4·7H2O......................................................0.3g
CaCO3 .................................................................0.2g
Potatoes, infusion from............................... 500.0mL
pH 5.6 ± 0.2 at 25°C
2. Nutrient Agar untuk kultivasi bakteri secara umum, komposisi per liter:
Agar.............................................................................15.0g
Peptone ..........................................................................5.0g
NaCl ..............................................................................5.0g
Yeast extract ..................................................................2.0g
Beef extract ...................................................................1.0g
pH 7.4 ± 0.2 at 25°C
3. Deoxycholate Agar untuk bakteri Pseudomonas komposisi per liternya:
Agar ............................................................................ 15.0g
Lactose ........................................................................ 10.0g
Peptone........................................................................ 10.0g
NaCl .............................................................................. 5.0g
K2HPO4......................................................................... 2.0g
Ferric citrate .................................................................. 1.0g
Sodium citrate ............................................................... 1.0g
Sodium deoxycholate.................................................... 1.0g
Neutral Red ................................................................. 0.03g
pH 7.3 ± 0.2 at 25°C
4. Nutrient Agar untuk kultivasi bakteri heterotrophic komposisi per liter:
Agar...............................................................................3.0g
Lab-Lemco beef extract ................................................1.0g
Peptone ..........................................................................1.0g
NaCl ..............................................................................0.5g
pH 7.3 ± 0.2 at 25°C
Berdasarkan sifat penggunaannya, medium kultur dapat dibedakan menjadi
medium umum, pengaya, selektif, diferensial, dan penguji.
1. Medium umum biasanya berupa medium yang dapat digunakan untuk
menumbuhkan kelompok mikroorganisme secara umum, misalnya: medium kultur
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
8
Nutrien Agar (NA) untuk menumbuhkan bakteri secara umum, dan medium
potato dextrose agar (PDA) untuk menumbuhkan jamur secara umum.
2. Medium pengaya merupakan medium kultur yang ditambah senyawa-senyawa
tertentu untuk memberi kesempatan kepada jenis atau kelompok mikroorganisme
tertentu supaya dapat tumbuh lebih cepat dibanding dengan mikroorganisme lain
yang sama-sama berada di dalam medium tersebut. Misalnya untuk memisahkan
bakteri Salmonella typhi, penyebab penyakit tifus yang berada di dalam kotoran
(tinja) manusia diperlukan senyawa pengaya menggunakan medium tetrationat
yang menghambat mikroorganisme lain selama 18-22 jam, sehingga diharapkan
bakteri Salmonella typhi sudah tumbuh dan dapat dipindahkan ke medium lain.
Medium Tetrathionate Broth komposisi per liter:
Na2S2O3....................................................................... 40.7g
CaCO3 ......................................................................... 25.0g
NaCl .............................................................................. 4.5g
Peptone.......................................................................... 4.5g
Yeast extract.................................................................. 1.8g
Beef extract ................................................................... 0.9g
Iodine solution .........................................................20.0mL
3. Medium selektif merupakan medium kultur yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu
atau beberapa jenis mikroorganisme tertentu. Contoh medium SSA (Salmonella-
Shigella Agar) yang hanya ditumbuhi oleh bakteri genus Salmonella dan Shigella.
Medium Salmonella Shigella Agar (SS Agar) komposisi per liter:
Agar.............................................................................13.5g
Lactose ........................................................................10.0g
Bile salts ........................................................................8.5g
Na2S2O3 .........................................................................8.5g
Sodium citrate ...............................................................8.5g
Beef extract ...................................................................5.0g
Pancreatic digest of casein ............................................2.5g
Peptic digest of animal tissue ........................................2.5g
Ferric citrate .................................................................. 1.0g
Neutral Red ............................................................... 0.025g
Brilliant Green .........................................................0.33mg
pH 7.0 ± 0.2 at 25°C
4. Medium diferensial merupakan medium kultur yang dipergunakan untuk
pertumbuhan mikroorganisme tertentu yang menampakkan ciri berbeda dengan
lainnya. Contoh medium tetrazoliumclor (TZC) membedakan bakteri
Pseudomonas solanacearum yang virulen dan avirulen. Tipe virulent strains
tampak koloninya tak beraturan (irregular) dengan pusat berwarna pink dikelilingi
warna keputihan, sedangkan yang avirulent tampak melingkar berwarna merah tua
dengan garis kebiruan.
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
9
Medium TZC komposisi per liter:
Agar.............................................................................17.0g
Peptone ..........................................................................1.0g
Glucose..........................................................................0.5g
Pancreatic digest of casein ............................................0.1g
2,3,5-Triphenyltetrazolium·HCl solution ................ 10.0mL
Medium kultur yang kita gunakan untuk membiakan mikroorganisme dapat
berbentuk padat, semi padat, dan cair. Medium kultur padat dan semi padat dapat
dibuat dari medium kultur cair yang ditambah ‘zat pemadat’. Zat pemadat yang
sekarang digunakan berasal dari ganggang merah yang biasa kita sebut ‘agar-agar’.
Agar-agar umumnya tidak dapat diuraikan oleh mikroorganisme dan membeku pada
suhu di bawah 50oC. Kandungan agar-agar sebagai pemadat medium kultur berkisar
1,5-2% dan untuk semi padat (semi solid) kurang dari 1%.
Setiap unsur nutrisi mempunyai peran tersendiri dalam fisiologi sel. Unsur tersebut
diberikan ke dalam medium sebagai kation garam anorganik yang jumlahnya berbedabeda
tergantung pada keperluannya. Beberapa golongan mikroorganisme misalnya
diatomae dan alga tertentu memerlukan silika (Si) yang biasanya diberikan dalam
bentuk silikat untuk menyusun dinding sel. Fungsi dan kebutuhan natrium (Na) untuk
beberapa jasad belum diketahui jumlahnya. Natrium dalam kadar yang agak tinggi
diperlukan oleh bakteri tertentu yang hidup di laut, algae hijau biru, dan bakteri
fotosintetik. Natrium tersebut tidak dapat digantikan oleh kation monovalen yang lain.
Jasad hidup dapat menggunakan makanannya dalam bentuk padat maupun cair
(larutan). Jasad yang dapat menggunakan makanan dalam bentuk padat tergolong tipe
holozoik, sedangkan yang menggunakan makanan dalam bentuk cair tergolong tipe
holofitik. Jasad holofitik dapat pula menggunakan makanan dalam bentuk padat, tetapi
makanan tersebut harus dicernakan lebih dulu di luar sel dengan pertolongan enzim
ekstraseluler. Pencernaan di luar sel ini dikenal sebagai extracorporeal digestion.
Bahan makanan yang digunakan oleh jasad hidup dapat berfungsi sebagai sumber
energi, bahan pembangun sel, dan sebagai aseptor atau donor elektron. Dalam garis
besarnya bahan makanan dibagi menjadi tujuh golongan yaitu air, sumber energi,
sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor tumbuh, dan sumber
nitrogen.
1. Air
Air merupakan komponen utama sel mikroorganisme dan medium. Funsi air adalah
sebagai sumber oksigen untuk bahan organik sel pada respirasi. Selain itu air
berfungsi sebagai pelarut dan alat pengangkut dalam metabolisme.
2. Sumber energi
Ada beberapa sumber energi untuk mikroorganisme yaitu senyawa organik atau
anorganik yang dapat dioksidasi dan cahaya terutama cahaya matahari.
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
10
3. Sumber karbon
Sumber karbon untuk mikroorganisme dapat berbentuk senyawa organik maupun
anorganik. Senyawa organik meliputi karbohidrat, lemak, protein, asam amino,
asam organik, garam asam organik, polialkohol, dan sebagainya. Senyawa
anorganik misalnya karbonat dan gas CO2 yang merupakan sumber karbon utama
terutama untuk tumbuhan tingkat tinggi.
4. Sumber aseptor elektron
Proses oksidasi biologi merupakan proses pengambilan dan pemindahan elektron
dari substrat. Karena elektron dalam sel tidak berada dalam bentuk bebas, maka
harus ada suatu zat yang dapat menangkap elektron tersebut. Penangkap elektron ini
disebut aseptor elektron. Aseptor elektron ialah agensia pengoksidasi. Pada
mikrobia yang dapat berfungsi sebagai aseptor elektron ialah O2, senyawa organik,
NO3 -, NO2 -, N2O, SO4 =, CO2, dan Fe3+.
5. Sumber mineral
Mineral merupakan bagian dari sel. Unsur penyusun utama sel ialah C, O, N, H,
dan P. unsur mineral lainnya yang diperlukan sel ialah K, Ca, Mg, Na, S, Cl. Unsur
mineral yang digunakan dalam jumlah sangat sedikit ialah Fe, Mn, Co, Cu, Bo, Zn,
Mo, Al, Ni, Va, Sc, Si, Tu, dan sebagainya yang tidak diperlukan jasad. Unsur yang
digunakan dalam jumlah besar disebut unsur makro, dalam jumlah sedang unsur
oligo, dan dalam jumlah sangat sedikit unsur mikro. Unsur mikro sering terdapat
sebagai ikutan (impurities) pada garam unsur makro, dan dapat masuk ke dalam
medium lewat kontaminasi gelas tempatnya atau lewat partikel debu. Selain
berfungsi sebagai penyusun sel, unsur mineral juga berfungsi untuk mengatur
tekanan osmose, kadar ion H+ (kemasaman, pH), dan potensial oksidasireduksi
(redox potential) medium.
6. Faktor tumbuh
Faktor tumbuh ialah senyawa organik yang sangat diperlukan untuk pertumbuhan
(sebagai prekursor, atau penyusun bahan sel) dan senyawa ini tidak dapat disintesis
dari sumber karbon yang sederhana. Faktor tumbuh sering juga disebut zat tumbuh
dan hanya diperlukan dalam jumlah sangat sedikit. Berdasarkan struktur dan
fungsinya dalam metabolisme, faktor tumbuh digolongkan menjadi asam amino,
sebagai penyusun protein; base purin dan pirimidin, sebagai penyusun asam
nukleat; dan vitamin sebagai gugus prostetis atau bagian aktif dari enzim.
7. Sumber nitrogen
Mikroorganisme dapat menggunakan nitrogen dalam bentuk amonium, nitrat, asam
amino, protein, dan sebagainya. Jenis senyawa nitrogen yang digunakan tergantung
pada jenis jasadnya. Beberapa mikroorganisme dapat menggunakan nitrogen dalam
bentuk gas N2 (zat lemas) udara. Mikroorganisme ini disebut mikrobia penambat
nitrogen
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
11
C. STERILISASI BAHAN DAN ALAT LABORATORIUM
Bahan dan alat-alat yang dipergunakan di dalam bidang mikrobiologi harus dalam
keadaan steril. Steril artinya tidak mengandung mikroorganisme, baik yang
mengganggu atau merusak bahan, alat, maupun proses laboratoris.
Ada tiga kelompok cara sterilisasi bahan dan alat laboratorium, yaitu secara fisik,
kimia, dan mekanik.
1. Sterilisasi secara fisik
Sterilisasi secara fisik biasanya menggunakan proses pemanasan, pembakaran,
atau radiasi.
a. Pemanasan basah bertekanan menggunakan alat yang disebut otoklaf
(autoclave). Otoklaf menyerupai bejana pengukus berisi air yang tertutup
rapat. Otoklaf mempunyai ruang yang mampu menahan panas dan tekanan di
atas 1 atm dan dilengkapi kleb-kleb pengaman ledakan.
Gambar: otoklaf (kiri) dan oven (kanan)
Mekanisme pada proses sterilisasi terjadi karena: air di dalam bejana yang
dipanaskan akan membentuk uap air. Pada tahap awal, biarkan kleb pengaman
dalam keadaan terbuka. Uap air akan ke ruang bejana dan mendesak keluar
semua udara yang ada di dalamnya melalui kleb tersebut. Jika udara telah
habis terdesak keluar bejana melalui kleb, maka kleb ditutup. Dengan
tertutupnya kleb ini maka suhu dan tekanan ruang sterilisasi di dalam bejana
akan naik terus sampai mencapai suhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer per
cm2. Sedikit di atas suhu dan tekanan ini kleb pengatur secara otomatis akan
membuka dan mengeluarkan uap air, sehingga suhu dan tekanan di dalam
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
12
bejana kembali ke suhu 121oC dengan tekanan 1 atm/cm2. Sterilisasi
menggunakan otoklaf ini biasanya dilakukan selama 15-20 menit dihitung
sejak kleb membuka pertama karena tekanan uap air.
Pemanasan basah selain digunakan untuk sterilisasi juga digunakan untuk
pasteurisasi dan tindalisasi. Pasteurisasi merupakan cara pemanasan, pertama
kali dilakukan oleh Louis Pasteur untuk mengurangi jumlah mikroorganisme
yang tidak kita inginkan di dalam suatu bahan menggunakan suhu ±70oC
selama 30 menit. Tindalisasi merupakan proses pemanasan bertahap, pertama
kali dilakukan oleh Tyndall untuk mengurangi jumlah mikroorganisme di
dalam suatu bahan, menggunakan suhu 100oC bertahap (3x). Pada suhu 100oC
biasanya hanya membunuh mikroorganisme pada bentuk vegetatif saja tetapi
tidak yang dalam bentuk tahan (spora). Biasanya bahan dipanaskan basah
(direbus, dikukus) selama beberapa menit (15-30 menit) kemudian dibiarkan
selama >8jam pada suhu kamar tanpa membuka tutup bejana dan dipanaskan
lagi selama 15-30 menit dan dibiarkan sekali lagi selama >8jam yang
akhirnya dipanaskan lagi. Pada tindalisasi dilakukan 3 tahap dengan tujuan
bahwa pada tahap pemanasan pertama digunakan untuk membunuh
mikroorganisme bentuk vegetatif. Pada tahap pendiaman pada suhu kamar
ditujukan untuk memberi kesempatan mikroorganisme bentuk alat tahan
tumbuh menjadi vegetatif, sehingga ia akan mati pada pemanasan tahap
kedua. Pendiaman tahap kedua bertujuan untuk memberi kesempatan alat
tahan yang belum tumbuh menjadi vegetatif, sehingga akan mati pada
pemanasan tahap ketiga.
b. Pemanasan kering biasanya menggunakan alat yang disebut oven. Sterilisasi
ini memanfaatkan udara panas dalam ruang oven. Suhu yang digunakan
berkisar 160o-220oC. Waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi 1-2 jam, lebih
lama dibanding menggunakan panas basah karena panas kering daya
penetrasinya lebih lemah dibanding panas basah bertekanan. Sterilisasi ini
hanya dapat digunakan untuk bahan dan alat yang memang tahan dan tidak
rusak oleh panas kering, misalnya alat-alat gelas (cawan petri, pipet, tabung
reaksi, gelas labu dan sejenisnya.
c. Pembakaran merupakan cara sterilisasi menggunakan api secara langsung.
Pembakaran merupakan cara sterilisasi yang paling efektif, tetapi hanya dapat
digunakan untuk alat-alat tertentu yang tidak rusak karena dibakar. Cara ini
biasanya digunakan untuk mensterilkan alat isolasi dan kultivasi
mikroorganisme yang dari logam, seperti jarum ose, jarum enten, dan skalpel
yang dibakar sampai memijar.
d. Radiasi merupakan cara sterilisasi menggunakan penyinaran gelombang
pendek. Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang yang dapat
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
13
membunuh mikroorganisme berkisar pada 220-290 nm dan yang efektif pada
= 253,7 nm. Penetrasi dari radiasi ultraviolet boleh dikatakan lemah sehingga
hanya berfungsi pada permukaan benda saja atau benda-benda yang sangat
tipis. Absorbsi sinar ultraviolet mengakibatkan modifikasi nukleoprotein
karena menimbulkan hubungan silang pasangan timin dan menyebabkan salah
baca kode genetika dan merusak fungsi vital mikroorganisme sehingga
mematikan.
2. Sterilisasi secara kimia dilakukan dengan bahan kimia yang membunuh atau
menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Bahan kimia yang biasa kita gunakan
untuk pekerjaan laboratorium adalah antiseptik. Antiseptik kimia biasanya kita
gunakan dan kita biarkan menguap, misalnya alkohol. Alkohol yang efektif dan
murah adalah isopropil alkohol 70%-90%. Penambahan yodium (iodin) ke dalam
alkohol akan meningkatkan daya antiseptiknya. Alkohol yang dicampur dengan
formaldehid (formalin) akan mampu membunuh spora (alat tahan)
mikroorganisme
Mempertimbangkan efek samping bahan kimia, maka pemilihan antiseptik lebih
diutamakan kepada kebutuhan dibanding tujuan. Banyak bahan kimia antiseptik
yang beracun, menimbulkan iritasi kulit, dan bahaya-bahaya lain yang harus
dipertimbangkan dalam penggunaannya. Zat-zat kimia yang dapat digunakan
sebagai antiseptik antara lain alkohol, senyawa halogen (klorin, yodium), fenol,
hidrogen peroksida, zat kristal violet, rosanalin, deterjen, logam berat (Hg, Ag,
As, Zn), aldehid, gas formaldehid (formalin), gas oksida etilen, dan -propilakton.
3. Sterilisasi secara mekanik digunakan untuk mensterilkan bahan atau alat yang
berubah, terurai atau rusak jika disterilkan dengan pemanasan maupun cara kimia,
misalnya ensim, serum, ekstrak sel, dan ruangan kerja. Alat yang digunakan untuk
sterilisasi ini umumnya berupa saringan (filter) yang tidak dapat dilalui
mikroorganisme, misalnya filter Berkefeld, filter Chamberland, dan filter Seitz.
Gambar: filter bakteri untuk cairan (kiri) laminar air flow bench (kanan)
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
14
Bahan-bahan yang berupa cairan (ensim, serum, ekstrak sel) disterilkan
menggunakan filter dengan matasaring lebih kecil dari pada ukuran
mikroorganisme.
Ruang kerja mikrobiologis harus dirancang bebas dari mikroorganisme. Untuk
mencegah pencemaran mikroorganisme udara maka udara yang masuk ke dalam
ruang tersebut dilewatkan terlebih dulu melalui filter. Ruang kerja tersebut
biasanya berupa kotak berukuran panjang 120 cm, lebar 75 cm, dan tinggi 75 cm,
kita sebut laminar air flow bench atau kotak enten.
D. KULTIVASI DAN ISOLASI (TEKNIK BIAKAN MURNI)
Kultivasi adalah usaha menumbuhkan mikroorganisme pada atau dalam medium
kultur. Isolasi adalah usaha memisahkan mikroorganisme dari suatu bahan atau
medium ke medium lain yang biasanya ditujukan untuk mendapatkan biakan sejenis
(biakan murni) tak tercampur oleh mikroorganisme lain. Pekerjaan tersebut harus
dipersiapkan dan dilakukan secara teliti, steril, dan aseptik. Aseptik artinya berusaha
mencegah atau mengurangi terjadinya kontaminasi (terikutnya mikroorganisme lain
yang tidak kita kehendaki ke dalam proses yang kita lakukan). Beberapa langkah
penting yang harus kita siapkan dan lakukan secara teliti, steril, dan aseptik yaitu:
1. Menyiapkan ruangan
Ruang tempat kultivasi dan isolasi mikroorganisme harus bersih, steril, dan bebas
angin. Dinding dan alas yang basah dapat menyebabkan butir-butir debu menempel
padanya, oleh karena itu ruang isolasi dapat diberi alas kain basah. Ruang tempat
kultivasi dan isolasi ini biasanya berupa enkas (ent case) atau laminar air flow yang
sudah dilengkapi dengan penyaring udara. Di laboratorium standar biasanya udara
yang masuk ke dalam ruangan telah dilewatkan pada ventilasi yang selalu disinari
dengan sinar ultraviolet (radiasi).
2. Pemindahan mikroorganisme
Pemindahan mikroorganisme dari satu medium ke medium lainnya dapat
dilakukan menggunakan jarum inokulasi (ose, jarum ent) atau menggunakan
pipet. Pemindahan menggunakan jarum inokulasi dilakukan dengan ujung kawat
(lebih baik kawat platina) yang sudah disterilkan dengan dibakar sampai pijar.
Untuk mikroorganisme unisel atau bentuk cairan dapat menggunakan ujung kawat
yang dibulatkan 1-3 mm (jarum ose) dan untuk mikroorganisme multisel
menggunakan ujung kawat yang dilebarkan (jarum ent). Pemindahan
menggunakan pipet dapat dilakukan jika mikroorganisme berada dalam cairan.
Pipet yang digunakan pun harus selalu steril.
3. Isolasi dan inokulasi (teknik biakan murni)
Di alam bebas tidak ada mikroorganisme yang hidup tersendiri terlepas dari
mikroorganisme lain. Sering berbagai jenis maupun kelompok mikroorganisme
kedapatan secara bersama-sama di suatu titik, tempat, maupun bahan tertentu. Oleh
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
15
karena itu, di dalam mempelajari suatu mikroorganisme diperlukan teknik untuk
menyendirikan (isolasi) mikroorganisme yang bersangkutan dari mikroorganismemikroorganisme
lainnya, kita sebut dengan teknik biakan murni. Di dalam
pelaksanaan teknik biakan murni tidak hanya bagaimana memisahkannya tetapi
juga bagaimana memelihara dan mencegah terjadinya kontaminasi (pencemaran)
dari mikroorganisme yang tidak kita kehendaki. Ada beberapa cara untuk
mendapatkan biakan murni, antara lain:
a. Cara pengenceran (dilution)
Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister (1865) yang berhasil membiakan
secara murnikan bakteri Streptococcus lactis yang diisolasi dari susu masam.
Cara mengisolasinya dengan mengencerkan sampel susu sampai beberapa
tingkat kemudian susu hasil pengenceran terakhir dipipet 100 μl untuk ditanam
sebar pada medium kultur padat. Hasil kultivasinya diperoleh beberapa koloni
terpisah yang masing-masing dapat dipelihara pada medium lain sebagai biakan
murni.
b. Cara penuangan (pour plate)
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
16
Cara ini pertama kali dilakukan oleh Robert Koch (1843-1905). Cara ini
sebenarnya tidak berbeda dari apa yang dilakukan oleh Lister, hanya saja Koch
menggunakan medium kultur semi padat yang sudah dicampur dengan sampel
yang diencerkan dituangkan ke dalam cawan, sedangkan Lister menanam
sampel yang diencerkan pada permukaan medium kultur yang sudah membeku
di dalam cawan. Hasil kultivasinya diperoleh beberapa koloni terpisah yang
masing-masing dapat dipelihara pada medium lain sebagai biakan murni. Di
cara penuangan ini ada dua orang pembantu Koch yang berjasa menciptakan
cawan untuk wadah biakan, yaitu Petri dan seorang lagi yang menemukan agaragar
sebagai pemadat medium kultur yang tidak mudah meleleh, yaitu Hesse.
Cawan yang diciptakan oleh Petri disebut cawan Petri (petridish) dan karena
yang dituang adalah medium kultur yang mengandung agar-agar maka teknik
ini disebut teknik agar tuang.
c. Cara penggoresan (streak plate)
Cara ini juga tidak jauh berbeda dengan cara Lister. Cara penggoresan
dilakukan dengan menyiapkan sampel bahan dan medium kultur padat. Sampel
bahan diambil menggunakan ose kemudian digoreskan pada permukaan
medium kultur yang sudah beku. Hasil kultivasinya diperoleh beberapa koloni
terpisah yang masing-masing dapat dipelihara pada medium lain sebagai biakan
murni
d. Cara penyebaran (spread plate)
Cara penyebaran dilakukan dengan menyiapkan sampel bahan dan medium
kultur padat. Sampel bahan diambil menggunakan pipet kemudian diteteskan di
atas medium kultur yang telah membeku dan tetesan sampel bahan diratakan di
permukaan atas medium kultur menggunakan gelas perata. Hasil kultivasinya
diperoleh beberapa koloni terpisah yang masing-masing dapat dipelihara pada
medium lain sebagai biakan murni
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
17
e. Cara pengucilan sel tunggal (single cell isolation)
Cara pengucilan sel tunggal dilakukan menggunakan alat khusus yang dapat
mengambil hanya satu sel mikroorganisme. Alat pengambilnya disebut
mikropipet yang ditempatkan pada mikromanipulator. Pengambilan sel diawali
dengan membuat tetesan bergantung pada gelas penutup preparat atau dalam
gelas preparat cekung. Pengambilan sel menggunakan mikropipet dilakukan
menggunakan mikroskop kemudian sel dipindah ke dalam medium kultur.
Kultivasi ini akan menghasilkan koloni yang berasal dari keturunan satu sel.
E. TEKNIK PEWARNAAN PREPARAT
Prinsip pengamatan mikroorganisme menggunakan mikroskop adalah mengamati
bayangan mikroorganisme yang terbentuk pada lensa dan tertangkap oleh mata kita.
Pada umumnya mikroorganisme, terutama bakteri bersifat tembus cahaya, sehingga
kalau diamati menggunakan mikroskop cahaya akan tidak atau kurang membentuk
bayangan dan akibatnya tidak terlihat atau terlihat bening (transparan) oleh mata kita.
Oleh karena itu, untuk menampakkan bagian-bagian sel tertentu perlu diwarnai. Zat
pewarna yang diadsobsi oleh sel akan membiaskan cahaya sehingga akan terlihat
kontras dengan sekelilingnya. Untuk menampakkan bagian inti sel diperlukan zat
pewarna inti sel, untuk melihat flagela, spora, maupun organel-organel lain di dalam
sel diperlukan zat pewarna khusus. Proses mewarnai sel, organel, atau benda lain
disebut pewarnaan. Sebagai contoh, misalnya pewarnaan secara Feulgen digunakan
untuk mewarnai inti, dan pewarnaan secara Gram digunakan untuk mewarnai dinding
sel. Pewarnaan mikroorganisme biasanya bertujuan untuk:
1. Mempermudah mengamati bentuk organel dan sel mikroorganisme
2. Memperjelas ukuran dan bentuk organel maupun sel mikroorganisme
3. Mengamati struktur luar dan dalam sel mikroorganisme
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
18
4. Mengamati reaksi mikroorganisme terhadap zat kimia sehingga sifat-sifat fisik
dan kimianya dapat diketahui.
Dari segi kimia, zat pewarna merupakan garam yang terdiri atas ion positif dan ion
negatif yang salah satu diantaranya berwarna. Zat pewarna akan bersifat basa jika
warnanya terletak pada ion positif disebut juga zat pewarna positif (Ion+Cl-). Zat
pewarna positif biasanya mempunyai ion negatif (anion) Cl, SO4, CH3COO,
COOHOO. Zat pewarna akan bersifat asam jika warnanya terletak pada ion negatif
disebut juga zat pewarna negatif (Na+Ion-). Zat pewarna negatif biasanya mempunyai
ion positif (kation) Na, K, Ca, dan NH3
Hubungan sel mikroorganisme dengan zat pewarna basa yang menonjol terutama
disebabkan oleh asam nukleat di dalam protoplasma sel. Jika sel mikroorganisme
yang asam nukleatnya berjumlah besar dan diwarnai maka muatan negatif di dalam
asam nukleat akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa. Contoh zat pewarna
basa yaitu zat kristal violet, safranin, dan metil biru. Sebaliknya zat pewarna asam
akan ditolak oleh muatan negatif dari mikroorganisme tersebut, sehingga
mikroorganisme menjadi tidak atau kurang terwarnai, tetapi latar belakangnya yang
terwarnai. Teknik ini sering sangat berguna untuk mengamati keseluruhan bentuk sel
yang sangat kecil. Proses pewarnaan latar belakang sel ini disebut juga pewarnaan
negatif.
Langkah-langkah laboratoris dalam mempersiapkan pewarnaan mikroorganisme
untuk diamati menggunakan mikroskop ada tiga tahap utama.
1. Penempatan obyek (spesimen) diusahakan setipis mungkin
2. Fiksasi spesimen dengan dipanasi supaya spesimen melekat erat pada gelas obyek
3. Aplikasi pewarna menggunakan pewarna sederhana (tunggal) atau serangkaian
pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial)
Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang hanya menambahkan pada
obyek yang telah difiksasi menggunakan satu jenis pewarna. Stelah 30-60 detik,
zat pewarna dibilas menggunakan air mengalir kemudian di kering anginkan dan
diamati menggunakan mikroskop. Pewarnaan sederhana ini ada dua macam, yaitu
pewarnaan positif dan pewarnaan negatif. Pewarnaan positif adalah pewarnaan
pada sel mikroorganisme (dapat menggunakan salah satu dari: zat kristal violet,
metil biru, safranin, dan sejenisnya), sedangkan pewarnaan negatif adalah
pewarnaan pada latar belakang obyek (biasanya menggunakan tinta Cina).
Pewarnaan diferensial merupakan teknik pewarnaan yang menampilkan
perbedaan diantara sel-sel mikroorganisme atau organel dan bagian lain dari sel.
Pewarnaan diferensial biasanya menggunakan zat pewarna lebih dari satu.
Bambang Purnomo. 2008. Materi Kuliah Mikrobiologi. Faperta Unib. Bengkulu
19
Contoh pewarnaan diferensial adalah pewarnaan gram, pewarnaan tahan asam,
pewarnaan Giemsa, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan flagela.
Pewarnaan gram merupakan salah satu contoh pewarnaan diferensial yang paling
luas digunakan untuk membedakan reaksi dinding sel mikroorganisme (terutama
bakteri). Pada pewarnaan gram digunakan dua zat pewarna, satu zat penguat, dan
satu zat peluntur. Ada empat tahap utama yang dilakukan pada pewarnaan gram,
setelah penempatan spesimen dan fiksasinya, yaitu:
a. Pewarnaan spesimen menggunakan zat kristal violet. Pada tahap ini semua sel
akan berwarna ungu.
b. Penguatan warna ungu menggunakan yodium. Pada tahap ini terjadi kompleks
kristal violet dengan yodium yang tetap berwarna ungu.
c. Pelunturan pewarna menggunakan alkohol. Pada dinding sel gram positif akan
mengalami dehidrasi, pori-pori dinding menyempit, dan daya rembes
membran menurun sehingga pewarna tidak dapat keluar dan tetap berwarna
ungu. Pada dinding sel gram negatif lipidanya akan terekstraksi keluar dinding
sel dan pori-pori dinding membesar sehingga pewarna keluar dari dinding sel
dan menjadi tidak berwarna (transparan).
d. Pewarnaan kedua menggunakan safranin. Pada sel gram positif pewarna kedua
tidak dapat diabsorbsi oleh dinding sel karena pori-porinya menyempit,
sehingga warnanya tetap ungu (warna kristal violet), sedangkan pada sel gram
negatif pewarna kedua ini akan diabsorbsi dinding sel sehingga warnanya
menjadi merah (warna safranin)
to be continue

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar